From the monthly archives: janvier 2012
A Davos en Suisse (dans la patrie de Roche) au forum économique mondial, Jonathan Rothberg présente son séquenceur Ion Proton, une évolution de son PGM de Life Technologies. La dépêche AFP (mise en forme par 20minutes est disponible en cliquant sur l’image ci-dessous) est dithyrambique replaçant la machine de Life Technologies dans le contexte et le champ d’application de la médecine personnalisée… jouant au passage du violon de l’affect. Le Ion Proton, fort de la démonstration menée par son petit frère le PGM depuis un an (200 machines PGM en Europe !) s’appuie sur l’efficience du séquençage à l’aide de semi-conducteurs.
Il parait évident que la médecine personnalisée aura un futur au sein des pays développés… mais il ne faut pas oublier qu’il s’agit d’un futur que l’on augurait aux puces à ADN, il y a plus de 10 ans, sans réelle démocratisation au sein des cliniques. Avant toute chose, permettre de séquencer l’équivalent d’un génome humain ou de 2 exomes humains pour la somme soutenable de 1000 $ (en 2 heures) laisse entrevoir une accélération des recherches biomédicales mais aussi de toutes les autres ! Cet outil qui torpille un MiSeq (Illumina) sorti trop tard, diffusera dans les laboratoires… il remporte, malgré ses défauts d’ores et déjà connus, la bataille du séquençage 2ème génération. Le prochain pari (plus aléatoire) porterait plutôt sur le séquençage 3ème génération dont la promesse est une lecture d’une molécule d’ADN ou d’ARN (non amplifiée artificiellement) dans son « état » originel (méthylé ou non par exemple). La 3ème génération unifie génomique et épigénétique.
Le Ion Proton devrait être livrable à partir d’octobre 2012, quelques chanceux pourront malgré tout réaliser des runs dès le milieu de l’année (il faut en acheter un minimum de 4 pour être un parmi ces privilégiés).
Un Ion Proton devrait avoir un coût proche de 140 k€ auxquels il vous faudra ajouter 65 k€ de serveur informatique.
La société suisse Roche tente de phagocyter la société californienne mastodonte, Illumina. Roche est prête à sortir un minimum de 5,7 milliards de USD de ses coffres suisses pour lancer une OPA inamicale – offre lancée le 24 janvier 2012 – sur la société leader de la biologie haut-débit. Illumina a été approchée par la société Roche afin de trouver un « terrain » d’entente, sans succès. Roche propose une offre valorisant l’action de 43 % par rapport à la valeur des cours des 3 derniers mois.
« Ensemble, les capacités de la division Diagnostics de Roche et d’Illumina, l’un des principaux fournisseurs de systèmes intégrés pour le séquençage de l’ADN, renforceront la position de Roche dans les secteurs Séquençage et Puces à ADN caractérisés par une demande croissante de solutions génétiques/génomiques », explique Roche, qui souligne qu’il « n’a pas ménagé ses efforts en vue de parvenir à une transaction négociée avec Illumina », mais que celle-ci « n’a pas voulu s’engager dans une discussion de fond ».
En temps de crise, les actionnaires ont bien souvent besoin de liquidité – valorisée qui plus est – il ne fait nul doute que cette OPA arrivera à ses fins… il ne s’agit pas nécessairement pour les scientifiques d’une excellente nouvelle, tant la concentration aux mains de peu se ressent par le moins de développement et des coûts croissants à supporter au niveau des laboratoires… Nous assistons à la création, au niveau des sociétés de biotechnologie, d’un monde bipolaire : Life vs Roche !
Le communiqué de presse de Roche concernant cette OPA est disponible ici.
Chaque année depuis 13 ans, l’AGBT (Advances in Genome Biology and Technology) rassemble les fournisseurs de technologies de pointe, quelques « maîtres » en la matière venant dispenser des cours du soir (sorte de « master-class ») et beaucoup de scientifiques essentiellement Nord-Américains. En effet, cette grande messe de la biologie haut-débit a lieu à Marco Island, île de Floride, lieu de villégiature pour retraités liftés percevant leurs fonds de pension sous forme de rente viagère.
La Côte Est américaine accueille les grandes entreprises de biotechnologies de la côte opposée pour démontrer que la Californie avec des sociétés telles que Illumina, Life technologies, Roche, Pacific Biosciences, Agilent… reste le meilleur fournisseur de technologies de pointes pour les gros centres de recherches situés sur la Côté Est (NIH, MIT-Broad Institute, Yale…). La Côte Est héberge les deux tiers des séquenceurs haut débit nord-américains. Depuis quatre ans, il faut bien le dire l’AGBT consacre le séquençage haut-débit, technologie qui vampirise la plupart des présentations (n’oublions pas que la jeune société PacBio sponsor principal, vend des séquenceurs…) et sessions « workshop »… au détriment de technologies plus « anciennes » (les puces à ADN par exemple). On le sait, ce type de rassemblements adoube la nouveauté et consacre ce que, parfois, hâtivement, on nomme : innovation.
Bien que ces rassemblements endogames sont critiquables, ils constituent une tribune pour les principaux axes de développements des technologies appliquées au vivant. L’AGBT est un tremplin dont se servent un grand nombre de firmes californiennes pour annoncer des lancements de machines à générer de la séquence. Cet évènement très américanocentré n’a pas de réel pendant européen, malgré les différentes formes prises par des rassemblements tels que le « carrefour des biotechnologies » remplacé par l’Eurobio-event. L’Eurobio-event sorte de biennale biotech’ où l’on trouve rassemblés beaucoup de vendeurs de robotiques, de pipettes… beaucoup de conférences traitant du business, de l’investissement dans les biotechnologies plus que des biotechnologies en tant que technologies. Assez peu de science dans Eurobio-event, beaucoup de business.
L’AGBT oscille quant à elle, entre un monde de scientifiques avide de nouvelles méthodes visant à l’exploitation rationnelle des flots de données issues de la biologie haut-débit (ce que représente l’illustration ci-dessus) et un monde de vendeurs de solutions appliquées à la recherche en biologie – quand les uns partagent un même « problème » et réfléchissent à une solution optimale pour sortir du sens biologique d’un amas de données, les autres vendent les générateurs de « problèmes » en misant sur la communauté scientifique mondiale pour apporter la réponse aux nouveaux problèmes générés. Il s’agit de trier l’information émanant de ce type de rassemblements en n’oubliant pas que cette vitrine – telle que peut l’être l’AGBT ou tout autre évènement de cette ampleur – peut parfois être un mirage scientifique plus qu’un virage technologique…
L’AGBT cette année 2012 aura lieu du 15 au 18 février sur l’île Marco Island : http://agbt.org/about.html, on y parlera de la technologie de Pacific Biosciences (des retours sur expériences sont prévus, avec leur 15 % de taux d’erreur de séquençage, il s’agit de LA déception technologique de l’année, mais PacBio est aussi LE sponsor principal de la réunion, quel suspens !), on y parlera aussi du futur Ion Proton…
Depuis la publication de 2006, d’Astier and al., J. Am. Chem. Soc., la communauté scientifique attendait la révolution du séquençage 3ème génération que constituait la géniale idée d’Oxford Nanopore : à savoir l’alliance des nanotechnologies, du génie génétique le tout à des fins de séquençage (et plus si affinité). Ainsi, un pore d’alpha-hémolysine (d’environ 1 nanomètre) ou la porine A de Mycobacterium smegmatis ou bien encore du graphène ont été investigués pour devenir le pore idéal dans lequel, après clivage par une exonucléase des liaisons phosphodiester, les bases azotées dont l’enchaînement constitue le séquençage passe afin d’être analysées (par analysées on entend lues, la lecture étant basée sur la différence de conductance électrique liée à la nature chimique des bases azotées). Le pari, pour Oxford Nanopore réside dans le fait de trouver un mode de détection suffisamment sensible pour analyser puis par puis un signal généré par le passage d’une base au travers de pores (autrement appelés trous). La résolution de la technologie constituait un défit, sa faiblesse provenait (espérons que ce verbe se conjugue aujourd’hui au passé) de la rapidité de passage des bases à travers le pore (1 à 5 µs / base)…
Une attente à émouvoir un James Dewey Watson, plusieurs publications en guise de démonstration de la faisabilité d’un tel séquençage, des appels de fonds ayant abouti à l’intégration d’Illumina au niveau du capital d’Oxford Nanopore (investissement en deux fois d’abord de 28 millions $ puis de 41 millions) ont maintenu en haleine les scientifiques avides de séquençage 3ème génération.
Oxford Nanopore est l’un des seuls acteurs européens, dans le monde du séquençage haut-débit où l’hégémonie californienne est écrasante… Alors que les Californiens (PacBio, Life, Illumina) communiquent à grand renfort d’annonces choc, Oxford Nanopore garde une part de mystère (aucune spécification réellement disponible à ce jour), nourrissant notre curiosité avec quelques publications scientifiques et quelques animations dont certaines vous sont présentées ci-dessous.
http://vimeo.com/18630569
Cette première animation reprend les différentes modalités de séquençage
http://vimeo.com/20289048
Avec la vidéo ci-dessus et celle ci-après, Oxford Nanopore réinvente le magnétoscope VHS à visée séquençage haut-débit…
http://vimeo.com/19288315
Finalement, le message à peine subliminal de ce court article : Oxford Nanopore est une société à surveiller de près… de plus en plus près.
Note : si les liens vers les vidéos ne fonctionnent pas essayer toujours en suivant celui-ci…
La HRM est une technique accessible (en temps/finance) sous diffusée. Loin d’avoir l’ambition de réparer cette injustice (à mes yeux), cet article vise à aborder une technique analytique de biologie moléculaire survolée, méconnue et snobée à l’heure de la biologie haut-débit.
La HRM (High Resolution Melt, Courbe de Fusion à Haute-Résolution) permet de distinguer des amplicons (produits PCR) variant d’un minimum de 1 base… (avec plus ou moins de difficulté selon que la mutation concernée est une transversion A/T ou un INDEL par exemple). Cette technique est l’alliance de machine qPCR permettant un contrôle fin de la température (pour ce qui nous concerne nous sommes les heureux possesseurs d’un RotorGene 6000, de Corbett dorénavant vendu sous le nom de Rotor-Gene Q, Qiagen) et d‘agents intercallants de l’ADN saturants et moins « toxiques » pour la PCR comme peut l’être l’EvaGreen. Au rayon des molécules fluorescentes pour cette application vous pourrez trouver le LC Green et LC Green Plus , le ResoLight, Chromofy, SYTO 9 et le SybrGreen I bien sûr ! (de toute évidence sur la plateforme RotorGene, cette molécule permet de bons résultats). Ainsi que le montre les courbes ci-dessous, après amplification, les produits de PCR sont chauffés jusqu’à complète dénaturation par pas de température les plus fins possibles, plus ceux-ci sont petits, plus la technique est résolutive. Le point d’inflexion (l’endroit où la dérivée s’annule) reporté en abscisses est le Tm du produit PCR préalablement amplifié. Or le Tm d’un produit PCR est dépendant de sa concentration, de la concentration en sels du milieu dans lequel il est solubilisé mais surtout de sa composition en bases azotées.
L’hétéroduplexe (la forme hétérozygote) montrera une courbe avec 2 points d’inflexions (ainsi que vous pouvez l’observer sur la courbe ci-dessus). Les 3 populations : homozygotes AA et BB, ainsi que la forme hétérozygote AB se distinguent entre elles.
Au niveau des stratégies de design puis d’analyse, un document plutôt bien réalisé est disponible ici. Les plateformes permettant de réaliser de « vraies » courbes HRM possèdent un logiciel permettant une normalisation qui facilite grandement l’interprétation des résultats.
Les applications de cette techniques sont évidentes :
– le génotypage à bas débit et très bas coût : de simples amorces suffisent (nul besoin de sondes internes doublement marquées) un mastermix contenant un fluorochrome et le tour est joué (il sera judicieux d’avoir sous la main des échantillons références homozygote des deux formes, au minimum). Bien designé, ce diagnostic de génotypage permet une discrimination des substitutions A/T (SNP de classe 4) les plus difficiles à distinguer compte tenu de la faible différence de Tm (autour des 0,2 °C) entre les deux formes.
– le criblage (screening) de mutants : cette application permet de réaliser un premier filtre en vue d’un séquençage (par exemple) sur des zones courtes de l’ADN potentiellement impliquées dans un phénotype particulier. La reproductibilité et la sensibilité de la technique est correcte comme le montre l’article Tù Nguyen-Dumont et al., BMC 2011
– méthylation de l’ADN : recherche de base 5-méthylcytosine (à l’aide d’un protocole bi-sulfite permettant de « remplacer » les cytosines non méthylées par des uraciles) à l’instar de ce que développe la publication dans NAR de Tomasz K. Wojdac et Alexander Dobrovic. Cette étude montre que l’intermédiaire de la MS-HRM (Methylation-Sensitive High Resolution Melting) il est possible de distinguer des zones méthylées à 0,1 % (ainsi que les courbes tirées de l’article sus-cité montrent pour des sensibilités descendant jusqu’à 1% d’amplicons méthylés, visibles ci-dessous).
En conclusion, la HRM est une technique largement méconnue et sous-employée, relativement simple à développer. Il est nécessaire de normaliser la concentration des échantillons (afin que ceux-ci aient des courbes d’amplification franchissant le seuil autour des 25 Ct). Dans l’idéal, la concentration en sels ne doit pas varier entre les échantillons… appuyé sur un bon design… et le tour est joué. De plus amples informations sont disponibles sur le site gene-quantification.info (la référence en matière de qPCR) ainsi que sur le site highresolutionmelt.co.uk.
Ion Proton Sequencer
Dernier né de la gamme des séquenceurs de paillasse, le « Ion Proton Sequencer » (149.000 $) est le premier de sa catégorie à permettre le séquençage en quelques heures du génome humain et à faible coût (1.000 $). A l’instar du PGM Ion Torrent, cette nouvelle plateforme est basée sur la technologie des semi-conducteurs (et la détection de la libération d’ions H+ suite à la polymérisation de dNTP).
La puce « Ion Proton ™ I »,disponible mi-2012, aura une capacité de séquençage 1000 fois supérieure au premier format de puce 314 du PGM Ion torrent soit 10 Gb (davantage orientée pour le séquençage d’exome humain). Le second format (puce « Ion Proton ™ II ») , disponible environ six mois plus tard aura une capacité de 100 Gb (Séquençage Génome humain).
Compte tenu de l’apparente similarité entre les deux plateformes de chez Life technologies, l’évolution réside essentiellement dans l’architecture de la puce avec une augmentation du nombre de puits ( 165 millions de puits pour la puce « Ion Proton ™ I » et 660 millions pour la puce « Ion Proton ™ II » soit respectivement 100 et 1000 fois plus que la puce 314 du PGM ), l’une des bases de la capacité de séquençage (en complément de la longueur des reads générés).
Qui sommes nous?
Christophe Audebert [@]
En charge de la plateforme génomique
du département recherche et développement
de la société Gènes Diffusion .
Renaud Blervaque [@]
Biologiste moléculaire, chargé d'études génomiques.
Gaël Even [@]
Responsable bioinformatique au sein
du département recherche et développement de la société Gènes Diffusion.
