Au cours des dix dernières années, la génomique connait une avancée technologique indéniable au travers des différents procédés de séquençage à haut-débit de deuxième génération. Néanmoins, certaines limites techniques subsistent, notamment par rapport à la quantité d’ADN requit, impliquant donc son extraction à partir de plusieurs millions de cellules. Cette contrainte implique une dilution de l’information pour des cellules aux fonctions biologiques bien souvent hétérogènes jusqu’au sein d’un même tissu.

En attendant la démocratisation du séquençage de troisième génération (Séquençage ADN sans amplification clonale) aux caractéristiques techniques qui permettraient un virage vers la génomique à l’échelle de la cellule unique , des méthodes alternatives appliquées à la seconde génération se développent afin d’accéder à cette hétérogénéité cellulaire. Ces solutions s’accompagnent donc, en amont du séquençage, d’une inévitable amplification de l’ADN de la cellule, préalablement isolée soit microdissection laser, système de microfluidique (ex: C1 Fluidigm), cytométrie en flux, ou encore micropipettage.

Ce poste est donc l’occasion de présenter la méthode d’amplification MALBAC, pour Multiple Annealing and Looping Based Amplification Cycles (Science, Zong et al.).

La méthode MALBAC repose sur l’utilisation de primers spécifiques (séquence de 8 nucléotides variables s’hybridant aléatoirement sur l’échantillon, couplée à une séquence connue de 26 nucléotides) générant des amplicons aux extrémités complémentaires. Cette particularité favorise la formation d’une boucle, évitant ainsi aux brins néo-synthétisés de servir à nouveau de matrice à la PCR et d’engendrer un biais d’ amplification (contrairement à la MDA). Ces étapes d’amplifications quasi-linéaires sont répétées cinq fois, puis les amplicons sont amplifiés par PCR exponentielle classique, en amont du séquençage.

MALBAC favorise une meilleure couverture de séquençage ainsi qu’une amplification plus uniforme (cf représentation ci-dessous) . De par ses performances, elle surclasse les méthodes conventionnelles tel que PEP-PCR, DOP-PCR ou encore MDA, pour Multiple Displacement Amplification, méthode la plus répandue depuis dix ans. Jusqu’à 83% de couverture à 10X de profondeur contre 45% pour la MDA. Parmi les autres atouts, la quantité d’ADN initiale requise n’est que de 0.5pg (contre 1000pg pour la MDA) et la polymérase Bst associée connait un taux d’erreur de 1/10000 bases.

Les performances de cette méthode permettent ainsi  de reconsidérer les études génomiques ciblant un matériel biologique rare. Parmi elles, l’analyse de cellules tumorales circulantes, de tissus microdisséqués, de cellules embryonnaires, de micro-organismes, de cellules foetales circulantes, , etc…