Parmi les technologies dédiées à la génomique, l’ « Optical Mapping » fait figure d’outil qualifiable d’alternatif. Cette approche repose sur une représentation graphique des sites de restrictions enzymatiques au travers d’un génome complet.
Les applications concernent aussi bien la génomique comparative (détection des délétions, insertions, inversions ou translocations), que le typage de souches (comparaison des cartes de restrictions). Aussi, conjuguée aux technologies de séquençage à haut-débit, elle permet également de répondre aux illusions fréquentes de l’obtention d’un « draft » de génome d’intérêt, nouvellement séquencé. Actuellement, OpGEN est la seule société proposant une solution semi-automatisée de cette technologie.
Techniquement, l’ « Optical mapping » consiste en (Cf fig ci-dessous):
– Une immobilisation des fragments d’ADN génomique extraits (1) au sein de canaux intégrés dans un support dédié (Argus System – OpGen) (2).
– Chaque molécule subit une digestion enzymatique (endonucléase de restriction) générant des sites de clivage, symbolisés ci dessous par les espaces (3).
– Le logiciel d’analyse (MapSolver) convertit ces données optiques en cartes moléculaires unitaires (4), qui alignées, fournissent une carte de restriction consensus du génome étudié (5).
L’utilisation de cette méthode, dans la perspective d’un assemblage efficace de génome, ne cesse de croître. En effet, elle permet de pallier les limites des NGS (Homopolymères, zones de génome peu ou non couvert) qui ne permettent bien souvent d’aboutir qu’à un nombre restreint de contigs (3′).
Il convient alors de créer une carte de restriction, in silico, de ces contigs (4′), à leur tour alignés sur l’ « optical map » du génome, sur la base des sites de clivage. Cette comparaison permet alors de positionner les contigs entre eux, de les orienter et de mettre en lumière les hypothétiques gaps. Le scaffold des contigs ainsi établi, associé à un séquençage Sanger des gaps permettent ainsi d’aboutir à un « draft » du génome étudié.
L’ « optical mapping » apparait comme un outil fiable et utile dans l’assemblage de génome, d’autant qu’il fait appel à une technique différente, indépendante mais à la fois très complémentaire au séquençage à haut débit.
La PCR en point final, celle qui se termine souvent par un dépôt sur gel d’agarose, ainsi que la PCR quantitative, dans laquelle on suit l’évolution de la libération de molécules fluorescentes dont le décollage plus ou moins précoce dépend de la quantité de matrice initialement introduite, se voient déclinées en versions numériques. Par numérique est entendu ici, qu’une PCR peut prendre deux valeurs : 0 ou 1 (idéalement, 0 quand aucune cible n’est introduite au départ d’une PCR et que par voie de conséquence aucun signal issu d’amplification n’est observé, et 1 pour l’exact inverse).
Le principe de la PCR numérique est simple au niveau du concept mais techniquement beaucoup plus difficile à mettre en application. Il s’agit de multiplier le nombre de bio-réacteurs disponibles, ainsi, un échantillon sera partitionné en des milliers de compartiments distincts. Ensuite chaque compartiment sera considéré comme autant de réacteurs indépendants… donc en fin de PCR autant de réactions montrant oui ou non une amplification (autant de 0 et de 1), renvoyant à un système binaire. L’application de la Loi de Poisson permettra ensuite d’estimer très finement la quantité initiale de cibles présentes dans l’échantillon de départ.
principe général de la PCR numérique
Les avantages de la PCR numérique par rapport à la qPCR classique sont assez évidents :
– elle permet une quantification absolue sans établir une courbe standard préalable
– elle est plus sensible voire beaucoup plus sensible. Raindance annonce ainsi détecter un mutant parmi 250 000 molécules sauvages avec une limite inférieure de détection de 1 parmi 1.000.000
– elle est moins sensible aux inhibiteurs. Le fait de diluer la matrice ADN complexe de départ pour la répartir dans un nombre important de réacteurs permet de favoriser le départ de PCR
– elle est nettement plus précise. La technologie sera d’autant plus précise que le nombre de compartiments, le nombre de micro-réacteurs sera important
L’article « Digital PCR hits its stride » (La PCR numérique franchit un nouveau cap) de Monya Baker dans le Nature Methods (juin 2012) permet un aperçu de la technologie qui est passée du concept à des solutions commerciales qui se veulent de plus en plus accessibles.
Actuellement, plusieurs fournisseurs proposent des plateformes aux spécifications très différentes. Les quatre fournisseurs ci-dessous proposent des systèmes de PCR numérique basés sur de la microfluidique pour Fluidigm, des interfaces solides (type OpenArray) de Life Technologies et des micro-gouttes pour Raindance et Biorad.
Ainsi, que le mentionne Jim Huggett (chef d’équipe au LGC), cité dans la publication de Monya Baker (Digital PCR hits its stride), la PCR numérique est réservée à des utilisateurs experts et se trouve encore allouée à des applications spécialisées car encore beaucoup plus chère que la PCR quantitative (traditionnelle) qui reste adaptée à la majorité des applications.
Plutôt bien réalisée, voici la campagne d’Illumina pour le lancement de son nouveau séquenceur le NextSeq500, un nouveau séquenceur de paillasse. Ce dernier né des séquenceurs SBS est capable de délivrer de 16 à 120 Gb, selon les modes de séquençage, avec des spécifications permettant d’envisager le séquençage par run de 16 exomes ou 20 transcriptomes ou encore 1 génome humain (à plus de 30 X de profondeur). Quoi qu’il en soit, ce nouveau venu et la campagne marketing qui en résulte, visent à populariser, démocratiser encore et toujours le séquençage pour mieux inonder le marché, c’est parti avec cette publicité…
A l’aube des années 2000, la génomique appliquée au domaine végétal fait l’objet d’une mobilisation internationale de grande ampleur comme en témoignent les programmes « Zygia » et « Gabi » en Allemagne, « Plant Genome Initiative » aux États-Unis, ou encore « Rice Genome Research Program » au Japon, qui poursuivent des objectifs analogues. Il devient primordial d’identifier les gènes et leur fonction jouant notamment un rôle décisif dans la production végétal (Rusticité, résistance aux maladies, aux herbicides, etc…).
Cette période est également marquée par l’achèvement du séquençage du génome de la plante modèle Arabidopsis thaliana, étape majeure dans la recherche en biologie végétale.
Simultanément, des collections de mutants d’insertions (T-DNA) chez A. thaliana sont créés au sein de nombreux groupes (SALK, GABI-Kat, Syngenta, INRA Versailles, etc…), et elles émergent notamment au travers du projet « Genoplante« , programme fédérateur en génomique végétale (Groupement d’Intérêt Scientifique regroupant à la fois des organismes publics tel que l’INRA, CNRS, Cirad, IRD et de puissants partenaires privés tel que Biogemma, Rhône-Poulenc Santé végétale et animale et Bioplante). L’idée est donc d’utiliser ces banques de mutants comme outils pour la génomique fonctionnelle appliquée à la plante modèle.
A l’époque, les solutions proposées pour l’identification des positions d’insertion du T-DNA au sein du génome sont nombreuses ( « Tail-PCR », « Inverse PCR », « Kanamycin Rescue » ). Néanmoins, ces approches restent fastidieuses: En plus de présenter certaines étapes techniques limitantes, elles sont également très chronophages.
Récemment, de nombreuses études ont commencé a démontrer l’énorme potentiel du séquençage à haut-débit dans l’identification des sites d’insertion de transposons. Le terme générique « Tn-Seq », pour « Transposon-Sequencing », est une variante du séquençage d’amplicons ciblés (Target-seq) et peut se décliner selon quatre méthodes comme illustrées ci-dessous (Tim van Opijnen and Andrew Camilli, Nature reviews – Microbiology (2013 July)). Elles dépendent notamment de la procédure de préparation de librairie de séquençage employée:
– Le »Tn-seq » et « INSeq » (respectivement pour « Transposon sequencing » et « Insertion sequencing ») sont deux approches très similaires reposant sur un séquençage d’amplicons obtenus à partir d’un couple d’oligos dont l’un cible le transposon. Seule la méthode de purification varie (Gel PAGE pour « INSeq » et Gel agarose pour « Tn-Seq)
– Le « HITS » et « TraDIS » (respectivement pour « High-throughput insertion tracking by deep sequencing » et « Transposon-directed insertion site sequencing ») sont également deux méthodes très similaires notamment en amont de l’étape de PCR de librairie.
L’alignement des données de séquençage (.fastq) sur le génome de référence, permet ainsi d’identifier la position du site d’insertion. L’illustration met en évidence les « reads » issus de la PCR de librairie ciblant les régions flanquantes au Transposon (« En vert » la bordure gauche, « en rouge » la bordure droite). Sur la base de cette méthode, il devient donc aisé d’identifier le nombre d’insertion potentielle.
L’utilisation des technologies de séquençage à haut-débit pour l’identification des sites d’insertion de T-DNA dans les banques de mutants révolutionnent les méthodes de criblage. Tout en s’affranchissant de techniques fastidieuses, cette approche de Tn-seq présente à la fois l’avantage de pouvoir gérer simultanément un très grand nombre d’échantillons (barcoding), à des coûts réduits et dans un délai des plus respectables.
En ce début d’année, cet article est l’occasion d’aborder rapidement les divers axes de développements, les différents acteurs du séquençage haut-débit de deuxième génération.
– Commençons par Life Technologies et sa gamme Ion Torrent. En fin d’année 2013, la Ion Community (forum où se retrouvent les utilisateurs de la technologie Ion Torrent) s’agite à l’annonce de 3 nouveautés majeures (early access program) :
(i) L’accès à une nouvelle chimie de séquençage, la Hi-Q ™, permettant d’accroître la fiabilité de séquençage. Les erreurs seraient réduites de 90 %, ceci même au niveau des homopolymères, et pour des reads de 400 bases, témoignage de Dag Harmsen à l’appui ! En clair, il semble que ce soit l’enzyme (what else ?) qui ait été remplacé.
(ii) La deuxième annonce concerne l’arrivée de la chimie Avalanche où plusieurs heures d’amplification clonale à l’aide d’un automate One-Touch peuvent être remplacées par l’emploi d’un tube, ce qui prend alors 2 heures pour obtenir une librairie de 500 pb, et ce, de façon isothermique. Un choc de simplification qui ravira les utilisateurs pour lesquels cette étape est limitante.
(iii) La troisième annonce concerne la mise à disposition de kits permettant de réaliser des analyses métagénomiques ciblées 16 S. Un système exploitant le PGM et sa capacité de produire des reads de 400 pb. L’inconnu ici réside dans la mise à disposition de la communauté d’un pipeline analytique performant.
– Qiagen, qui n’est pas connu pour être un acteur de poids sur la scène du séquençage haut-débit, arrive en force en cette année 2014 avec une solution intégrant tous les jalons nécessaires à la complétude d’une étude. Fort de son rachat d’une solution de séquençage (lire l’article : Qiagen investit… le séquençage haut-débit de 2ème génération), Qiagen propose un environnement logiciel des plus intéressants ! En effet, la société néerlandaise a racheté les sociétés CLC Bio et Ingenuity systems. Ces deux sociétés proposent l’une des toutes meilleures solutions d’analyse de séquences: une solution d’assemblage de novo réellement performante grâce à CLC genomics workbench, et Ingenuity systems proposant les pipelines d’analyses suivants: IPA, pour donner un sens biologique aux données omiques, Ireport pour l’analyse de données d’expression et Variant Analysis, un pipeline permettant d’optimiser la recherche de mutations causales.
Ainsi QIAGEN, à l’instar de ce que nous avons tâché de représenter par le schéma ci-dessous, possède actuellement tous les maillons (ou pas loin) d’une chaîne allant de l’échantillon à l’analyse finale traduisant des données de séquences en sens biologique.
– Illumina, quant à elle, semble avoir l’ambition de devenir une sorte de Apple de la « génomicosphère ». En effet, Illumina propose BaseSpace, un Itunes pour les biologistes. D’ailleurs, notons qu’Illumina propose sur Itunes une application : MyGenome, qui propose « d’explorer un véritable génome humain » et d’afficher des rapports sur les variations génétiques importantes. « L’application MyGenome fournit une interface simple, intuitive, et éducative pour vous lancer à la découverte du génome humain« . Revenons à BaseSpace, une interface entre vous et un cloud hébergeant des applications et des données permettant d’analyser les séquences en sortie de MiSeq ou HiSeq. Ce cloud permet aux utilisateurs de délocaliser le stockage de leurs données. L’idée : simplifier au maximum l’analyse par la mise à disposition d’outils et la mise en réseau des utilisateurs. Illumina s’est aperçu que si le goulot d’étranglement constitué par l’analyse de données de séquençage haut-débit volait en éclat, nécessairement les runs pourraient se multiplier avec leur chiffre d’affaire. Le schéma ci-dessous reprend quelques éléments de la solution analytique développée par Illumina.
Une communauté de plus de 12000 utilisateurs, un espace permettant l’utilisation d’une vingtaine d’applications. L’objectif d’Illumina : créer un espace attractif, émulant et incitant les intervenants à mettre à disposition les applications développées en priorité sur cet espace. Anticipant une demande exponentielle d’analyses et d’espace de stockage lorsque le HiSeq a été intégré au BaseSpace, Illumina a décidé de mettre en place une politique de tarification qui limiterait la quantité d’espace libre pour stocker et traiter les données génomiques dans le cloud. En vertu de cette logique, les utilisateurs reçoivent un téraoctet gratuit d’espace pour le stockage et le traitement des données et seraient alors en mesure d’acheter du stockage supplémentaire par incréments de téraoctet ou 10 téraoctets – un téraoctet coûterait 250 $ par mois ou $ 2,000 d’avance pour une année complète , tandis que 10 téraoctets seraient à 1500 $ par mois ou une avance des frais annuels de $ 12 000 (données chiffrées début 2013).
En conclusion, si les années précédentes ont vu le lancement de nouveaux séquenceurs, avec depuis 2011 l’arrivée de séquenceurs de paillasse, les années 2013-2014 attendent la diffusion de séquenceurs de 3ème génération. Qiagen est un petit nouveau dans la course, ce nouvel acteur est capable, sans réel développement, de proposer une solution complète grâce à une stratégie de rachat pertinente. Illumina et Life Technologies, pendant ce temps, poursuivent leur développement en essayant d’émuler les utilisateurs avec, respectivement, leur BaseSpace et Ion Community. L’opérateur historique, Roche est le grand silencieux avec une stratégie peu lisible…
La toute puissante FDA (Food and Drug Administration) a calmé les ardeurs la société 23andMe en remettant en question la diffusion par la société californienne de tests génomiques personnels. (Étonnamment ?), la FDA ne semble pas réellement heurtée par le principe même d’une société de droit privé glanant des informations génomiques pour réaliser un commerce des plus lucratifs, motus concernant le devenir de ce type de données. En réalité, l’administration américaine, soucieuse du service rendu au consommateur, émet des doutes quant à la pertinence, quant à l’exploitation des résultats, après génotypages, des individus consentants, ainsi que sur la façon dont le tout est présenté au consommateur. Ainsi, 23andMe est mise en cause au niveau de la qualité de son service. Voici son seul « crime » aux yeux de la FDA!
L’administration américaine lui reproche :
– malgré les sollicitations récurrentes de la part de la FDA, 23andMe n’a pas fait valider par l’administration ses dispositifs diagnostiques in vitro. Elle n’a cessé d’allonger la liste (stratégie commerciale du restaurant chinois) des maladies et caractères que leur système était susceptible de diagnostiquer -avant « sa mise en demeure », 23andMe proposait un menu comportant le « diagnostic » de 254 prédispositions à des « maladies » ou aptitudes diverses.
– au sujet des maladies multi-factorielles, telles que le cancer de l’ovaire ou du sein, les résultats rendus aux clients sont très probablement constitués d’un grand nombre de faux positifs et de faux négatifs.
la FDA souhaite que l’intégralité des assertions de 23andMe soit validée pour que la société continue de vendre son kit phare : health-related genetic tests.
La société qui comptait régner en maître sur le marché de la génomique récréative, a peut-être fini de jouer les apprentis sorciers (franchement peu probable !). En effet, si l’intérêt de certains de ces tests génomiques, en soi, n’est pas à remettre en question, leur encadrement législatif est à souhaiter. En outre, avant de valider des kits « diagnostiques », il serait appréciable de lever le quiproquo : les kits proposés par 23andMe sont ils des dispositifs de génomique récréative ou des dispositifs médicaux ? La libéralisation incontrôlée de ce type de marchés pourrait avoir des conséquences dramatiques… Si des prédispositions peuvent être inscrites dans notre code génétique, il n’en demeure pas moins qu’une large majorité de maladies peut être qualifiée de multifactorielle.
Se sentir à l’abri d’une maladie parce que 23andMe vous rend un résultat dans ce sens ou dans le cas contraire, sentir l’ombre de l’épée de Damoclès, peut avoir, pour le consommateur de ces tests, des conséquences graves.
La lettre d’avertissement du 22 novembre 2013, de la FDA adressée à Anne Wojciki, montre l’étendue de l’ambiguïté : LETTRE d’AVERTISSEMENT ainsi que la réponse de 23andMe.
Anne Wojcicki a déclaré que « 23andMe travaille activement avec la FDA pour s’assurer que la firme fournit des informations de haute qualité afin que les consommateurs puissent avoir confiance ».
Ci-dessous, voici la nouvelle page qui vous accueille sur le site de 23andMe qui peut continuer à vendre ses tests phylogénétiques.
Comme le disait Stephen Hawking :
« J’ai remarqué que même les gens qui affirment que tout est prédestiné et que nous ne pouvons rien y changer regardent avant de traverser la rue. » (Trous noirs et bébés univers, Éditions Odile Jacob, 1994)
Le séquençage du génome humain pour 30$, c’est la promesse faite par David Weitz, co-fondateur de GnuBio au cours de l’année 2010. Trois ans plus tard, la start-up vient de lancer en béta-test son nouveau procédé de séquençage à haut débit. Il s’agit du premier système entièrement intégré (amplification des cibles, enrichissement, séquençage et analyse) qui propose pour le moment une application de target-sequencing destinée aux cliniciens et dédiée au diagnostic moléculaire.
En 2010, David Weitz et son équipe de l’Université d’Harvard ambitionnent de développer une nouvelle technologie de séquençage à haut-débit, alliant les technologies de biologie moléculaire aux procédés de microfluidique développés quelques années plus tôt (2004) au sein de la société RainDance technologies.
Cette nouvelle approche repose sur la capacité à générer des gouttes de l’ordre du picolitre et pouvant être déplacée sur une puce microfluidique. Ces gouttes peuvent renfermer soit un couple d’amorces, des adaptateurs, ou tout autre type de réactifs nécessaires aux étapes de préparation de librairie et de séquençage (séquençage par hybridation-ligation, type SOLiD avec une fidélité de 99.99%). Dès lors, leurs quantités utilisées au sein de ces picogouttes sont considérablement revues à la baisse, ce qui constitue le point clé à une réduction des coûts de séquençage et donc la perspective d’un séquençage de génome humain à 30$, selon David Weitz.
Les projets de GnuBio sont désormais d’élargir le champs d’applications de leur séquenceur à l’analyse transcriptomique (RNA-seq), l’étude de la méthylation (ChiP-seq) ou encore le séquençage de génome entier. La société ambitionne une commercialisation de leur équipement au cours de l’année 2014.
A suivre…
Le séquençage haut-débit voit cohabiter depuis quelques années deux générations de séquenceurs.
Au passage, une question Trivial Pursuit pour laquelle il faudra avoir un œil de caracal : quelqu’un sait quelle société a développé la première génération de séquenceurs haut-débit ? et quand ?
Les séquenceurs de deuxième génération se voient conditionnés sous forme de séquenceurs de paillasse (PGM de Ion Torrent, Miseq d’Illumina, GS-junior de Roche) permettant une démocratisation du séquençage, pendant que leurs grands frères pulvérisent la loi de Moore pour envisager un rendement (coût / Mb) toujours plus compétitif.
La large diffusion du séquençage de 3ème génération se laisse désirer laissant le champ libre à la génération précédente. Cet article vise à réaliser un court état des lieux du séquençage haut-débit de troisième génération : un futur plus ou moins lointain, de nouvelles applications potentielles.
La question : séquenceurs de 3ème génération, l’âge de raison, c’est pour quand ? est l’interrogation qui a hanté l’AGBT 2013 marqué par le silence d’Oxford Nanopore. Cette année 2013 fut marquée par le retrait d’Illumina du capital de la société britannique : « Oxford Nanopore Technologies Ltd a annoncé la vente d’une participation détenue par son concurrent américain Illumina Inc., une étape vers la fin d’une relation pleine de conflits dans la course au développement des séquenceurs haut-débit permettant de séquencer plus rapidement et pour moins cher. »
Avant de caractériser ce que sont, seront, pourront être les 3ème générations de séquenceurs, commençons par un rapide tour des caractéristiques générales de leurs prédécesseurs et principalement de ce qui constitue leurs points faibles :
– la phase d’amplification clonale (réalisée par PCR) est source de biais (doublons, erreurs de PCR)
– les problèmes liés au déphasage engendrant une chute de la qualité le long du read produit (ce qui bride la production de reads vraiment longs)
-des reads courts (de moins d’une centaine à environ 800 bases – vous l’aurez noté ce point est en partie une conséquence du précédent)
-des machines et des consommables onéreux
– des temps de run longs
Ainsi l’objectif principal des séquenceurs de 3ème génération est de palier les défauts de leurs aînés en produisant des reads plus longs, plus vite pour moins cher. Les séquenceurs de 2ème génération, quels que soient leurs modes de détection (mesure de fluorescence, mesure de pH) sont trop peu sensibles pour envisager la détection d’une simple molécule, d’un simple nucléotide : nécessairement la librairie doit être amplifiée, ce qui provoque des biais, des temps de préparation relativement longs et l’usage de consommables qui impacte le coût final de séquençage… assez rapidement la qualité chute plus vos reads s’allongent ce qui oblige à brider les tailles de reads que ces technologies sont capables de délivrer. En outre, travaillant sur une matrice qui est une copie de votre librairie initiale, l’information portée par les bases méthylées est perdue (ceci oblige à ajouter une phase de traitement au bisulfite qui peut être hasardeuse)
Actuellement l’une des seules technologies de 3ème génération réellement utilisée est celle de Pacific Biosciences (les hipsters disent « PacBio »). La firme, fondée en 2004, a lancé en 2010, son premier séquenceur de troisième génération le Pacbio RS basé sur une technique de séquençage SMRT (Single Molecule Real Time sequencing.) Aujourd’hui la société Roche qui n’a pu absorber Illumina lors de son OPA, a investi 75 millions de USD, le 25 septembre 2013, pour co-développer des kits diagnostiques in vitro exploitant la technologie de PacBio.
La technologie de PacBio est aujourd’hui exploitée pour réaliser du séquençage de novo de petits génomes :
Avec ces 200 à 300 Mb délivrés par SMRT-cell, séquencer des organismes eucaryotes supérieurs demande un investissement important, malgré tout, cette technologie délivrant des reads de plusieurs milliers de bases, permet d’envisager une diminution du nombre de contigs obtenus par les seules stratégies reads-courts / gros débit.
Face à la technologie proposée par PacBio, d’autres technologies essaient d’émerger pour arriver à occuper le marché du séquençage de 3ème génération :
– La combinaison détection optique et multipore est une voie envisagée pour le séquençage de 3ème génération avec le travail mené par NobleGen biosciences.
– L’imagerie directe de l’ADN
Le microscope électronique offre une résolution possible jusqu’à 100 pm, de sorte que les biomolécules et les structures microscopiques tels que des virus, des ribosomes, des protéines, des lipides, des petites molécules et des atomes même simples peuvent être observés. Bien que l’ADN est visible lorsqu’on l’observe avec un microscope électronique, la résolution de l’image obtenue n’est pas suffisamment élevée pour permettre le déchiffrement de la séquence, c’est à dire, le séquençage de l’ADN. Cependant, lors du marquage différentiel des bases de l’ADN avec des atomes lourds ou des métaux, un tel séquençage devient possible.
– Le séquençage à l’aide de transistor (Transistor-mediated DNA sequencing– une technologie développée par IBM)
Dans le système conceptualisé par IBM, l’ADN est contraint de passer par le pore à cause de la tension électrique subie, la vitesse de passage de la molécule à séquencer est maîtrisée à l’aide de contacts métalliques à l’intérieur du nanopore. La lecture des bases serait réalisée lors du passage de l’ADN simple brin au travers du pore (ça rappelle quelque chose…)
– Et Oxford Nanopore dans tout cela ? Si la société anglaise a annoncé la vente de la participation d’Illumina, elle a marqué l’année 2013 par son silence assourdissant. Passé l’oxymore, en cette fin d’année, coup de poker ou réel lancement, Oxford Nanopore propose un programme d’accès à sa technologie Minion où pour 1000 USD, il est possible de postuler à l’achat des clés USB de séquençage.
La stratégie d’Oxford Nanopore est basée, en partie, sur la possible démocratisation du séquençage de 3ème génération, elle s’oppose à celle de PacBio qui mise sur son arrivée précoce sur le secteur du séquençage haut-débit : décentralisation contre l’inverse. En clair, l’investissement d’un PacBio est tel que l’outil est réservé à des centres, des prestataires de services pouvant assumer cet investissement, ce qui oblige à centraliser les échantillons pour les séquencer, contre les produits (encore en développement) d’Oxford Nanopore dont la promesse est : le séquençage pour tous (ou presque).
PacBio revendique sa participation à un projet qui consiste à doubler la quantité de génomes bactériens « terminés » (actuellement de 2384) en quelques mois.
En cliquant ci-dessus sur la représentation graphique qui illustre la différence de plasticité de génome entre le génome d’une Bordetella pertussis (l’agent pathogène responsable de la coqueluche) et celui d’Escherichia coli, un poster vous apparaîtra. Ce dernier reprend les caractéristiques de l’utilisation de la technologie de PacBio à des fins d’assemblage de novo de génomes bactériens par une stratégie non-hybride (seuls des reads de PacBio sont utilisés). Les résultats sont assez bluffants, la longueur des reads de PacBio permet un assemblage complet (au prix de plusieurs SMRT cells tout de même !), de génomes bactériens « difficiles » tel que celui de Bordetella pertussis connu pour posséder un GC % relativement élevé (environ 65 %) ainsi que de nombreux éléments transposables. Les génomes possédant de nombreux éléments répétés posent de grandes difficultés d’assemblage, c’est un des arguments qui permet à PacBio de positionner sa technologie actuellement… en quelques mois les stratégies hybrides (reads courts générés par des séquenceurs de 2ème génération) ont laissé place aux stratégies non-hybrides où le séquençage PacBio se suffit à lui-même.
L’évolution des technologies de biologie moléculaire combinée à des systèmes de détection toujours plus sensibles, des techniques d’amplification accessibles dans des systèmes intégrés ont rendu possible l’analyse du transcriptome d’une cellule isolée. Dans de nombreux domaines tels que la cancérologie, la biologie des cellules souches, l’ingénierie des tissus, le signal moyen peut cacher la pertinence du signal noyé dans la masse des cellules d’intérêt.
Défier la loi de la moyenne, en tenant compte de l’hétérogénéité cellulaire pour tenter de capter ce signal qui échappe aux systèmes n’analysant que le mélange de cellules, est le credo du système proposé par Fluidigm : le C1™ Single-Cell Auto Prep System.
Isoler des cellules pour extraire leur ARN peut être une tâche technique ardue consommatrice de temps et très sensible aux contaminations.
La société américaine, Fluidigm propose donc un système plutôt simple permettant de capturer quelques cellules pour en extraire leurs acides nucléiques. Le consommable est composé d’une plaque microfluidique comportant 96 pièges à cellules enchaînés. La multiplicité de ces pièges permet d’accroître les chances de capturer une cellule dans l’état escompté. Une fois la phase de capture accomplie, les divers pièges sont individualisés. Un système de by-pass permet de « pousser » chacune des cellules piégées dans une succession de « microréacteurs » isolés enchaînant phases de lyse, de transcription inverse, d’amplification des ARNs (WTA) et de collecte des acides nucléiques amplifiés.
Le schéma ci-dessous reprend les 2 phases principales permettant d’aboutir à l’analyse du transcriptome de cellules isolées :
(i) l’amplification d’ARN de cellules isolées
(ii) l’analyse de ces ARNs
Ainsi que le montre la vidéo promotionnelle ci-dessous le système est compact et se veut simple d’utilisation. Il va de soi, malgré tout, que pour optimiser vos chances de capturer un signal d’intérêt un marquage préalable cellules vivantes/mortes peut s’imposer. Ceci impose aussi d’observer la plaque microfluidique au microscope à fluorescence (en se hâtant quelque peu). Bien évidemment l’adjonction de marqueurs discriminants (anticorps couplés à un agent fluorescent) est la bienvenue.
Cette dernière vidéo aborde le « workflow » aboutissant à l’analyse du transcriptome monocellulaire par Biomark, il va de soi qu’il s’agit là d’une « suggestion de présentation » puisqu’il est possible d’analyser le transcriptome amplifié par le système C1™ Single-Cell Auto Prep System avec un grand nombre de systèmes de qPCR ou de séquençage haut-débit.
http://youtu.be/TF4NJRE4Xg4
L’analyse des biomarqueurs des cellules tumorales circulantes devient un élément majeur de la médecine personnalisée (lire L’enjeu des cellules tumorales circulantes). L’article d’Ashley A. Powell et al. (Single Cell Profiling of Circulating Tumor Cells: Transcriptional Heterogeneity and Diversity from Breast Cancer Cell Lines (Plos One, 2102)) montre l’application de ce système au niveau de l’analyse de « biopsie liquide« .
L’outil proposé par Fluidigm trouve d’ores et déjà des applications cliniques très concrètes : l’analyse de biomarqueurs des cellules tumorales circulantes à visée pronostique.
La diversité du parc technologique des séquenceurs de deuxième génération n’est plus une surprise pour personne. Ceci étant, il devenait indispensable de mettre à jour l’ensemble des informations postées sur ce site, il y a exactement deux ans (2011), faisant un état de l’art des différentes caractéristiques technologiques des séquenceurs, ainsi que les possibles applications biologiques associées.
Pour ne mentionner que les trois plus gros fournisseurs du marché, les sociétés Roche, Illumina et Life Technologies n’ont cessé de faire évoluer leur gamme, tant sur le plan des équipements que sur le plan des capacités de séquençage.
Par voie de conséquence, ce survol est l’occasion de refaire le point sur les technologies appropriées selon l’application biologique recherchée. A noter que le Ion proton, dernier en date sur le marché des séquenceurs de deuxième génération disposera au cours de l’année 2014 d’une puce « PIII » permettant de générer environ 64Gb. Cette capacité de séquençage permettra à Ion torrent de se positionner sur le séquençage de génome humain à partir d’un séquenceur de paillasse et accèdera ainsi à la gamme complète des applications citées ci-dessous.
Qui sommes nous?
Christophe Audebert [@]
En charge de la plateforme génomique
du département recherche et développement
de la société Gènes Diffusion .
Renaud Blervaque [@]
Biologiste moléculaire, chargé d'études génomiques.
Gaël Even [@]
Responsable bioinformatique au sein
du département recherche et développement de la société Gènes Diffusion.
