Souvent perçu comme une évidence, le dosage d’acides nucléiques est un point fondamental. Il faut pourtant le considérer comme le premier « monitoring » important d’une expérience de biologie moléculaire. Que vous soyez équipés d’un NanoDrop™, d’un plus antique spectrophotomètre, d’un fluorimètre… les outils sont parfois complémentaires et ont des spécificités propres qu’il vous faudra évidemment connaître (au moins approximativement).

En matière de dosage des acides nucléiques, il apparaît fondamental (si vous utilisez un spectrophotomètre)  de connaître la fameuse loi de Beer où A=Ɛ.l.C

A étant l’absorbance (sans unité) et Ɛ est le coefficient d’absorption moléculaire (unité : L.mol ^-1 .cm^-1)

l : la longueur du trajet optique (valeur fixe, donnée par l’épaisseur d’une cuve ou d’un ménisque sur un Nanodrop) (unité : cm)

C, souvent ce que l’on souhaite déterminer: la concentration d’acides nucléiques (unité : mol.L^-1)

Cette formule permet d’estimer assez aisément une concentration en acides nucléiques, elle est vérifiée lorsque la solution est de concentration inférieure à : c < 0,1 mol.L^-1

Assez rapidement, la concentration, le plus souvent en ng.µL^-1, est déduite. Le point fort de la méthode spectrophotométrique (comparée à la méthode fluorométrique, plus sensible, quant à elle) est fournie par les informations que l’on tire des ratios suivants:

spectre typique relatif à un dosage d'acides nucléiques

Ratio A260/A280 : un ratio de 1,80 (+/- 0,1)  permet de qualifier une extraction d’ADN comme pure, ce ratio se situe autour de 2,0 pour une extraction d’ARN (+/- 0,1). Si ce ratio est inférieur cela signifie que l’extraction est polluée par des protéines et/ou des composés phénoliques

Ratio A260/A230 : la valeur attendue de ce ratio se situe entre 2,0 et 2,20. Si ce ratio est plus faible cela indique nécessairement qu’un composé absorbe à 230 nm. Ces composés peuvent le plus souvent être de l’EDTA, des sucres, et encore une fois le phénol et particulièrement le TRIzol reagent.

Ces valeurs de ratios peuvent parfois être négligées, cependant elles donnent une indication quant à la présence d’éventuels inhibiteurs qui viendraient perturber le devenir de vos acides nucléiques (PCR et autres réactions enzymatiques). Il est important de réaliser une valeur de blanc sur la solution qui vous aura servi à éluer vos acides nucléiques (car comme il a été précédemment mentionné l’EDTA absorbe à 230 nm… et bien souvent le TE 1X sert à reprendre et conserver des acides nucléiques)

vous trouverez ci-contre le mode d’emploi du Nanodrop 1000.

Une autre méthode alternative, permettant une meilleure sensibilité : méthode picogreen. Cette méthode, bien que très sensible, donne des résultats non valides (car très largement sous-estimés) dès lors que votre solution d’acides nucléiques est polluée par des traces d’agents détergents (type SDS). En effet, ces « adjuvants » quenchent la fluorescence émise par l’agent qui s’intercale au sein des acides nucléiques que l’on souhaite doser.

Note : bien souvent il vous est utile de calculer la quantité de molécules (quantité de copies).

Sachant que la masse molaire moyenne d’une base azotée  => Masse Molaire (MM) : 309 g.mol-1

&

avec le nombre d’Avogadro 6,02214129.10²³ molécules.mol^-1

La formule devient : nombre de copies pour 1 µL = [C (concentration mesurée en ng/µL) x V (volume, ici 1 µL) x 10-⁹ ]/ [(MM environ 309 g.mol-1) x la taille de votre génome en pb x 2] le tout que l’on multiplie par le nombre d’Avogadro… le tour est joué !

plus simplement : 978 Mb pèsent 1 pg  (en avant le produit en croix).