La paléontologie, la science des fossiles et des traces de vie du passé, use de méthodes de biologie moléculaire de pointe qui  pallient les effets du temps qui passe…

Afin d’introduire ce premier article traitant de paléogénomique, les moyens de la biologie moléculaire au service de la paléontologie, une vidéo amuse-bouche (Auteur(s) : Eva-Maria Geigl, Réalisation : Samia Serri, Production : Université Paris Diderot, Durée : 17 minutes 40 secondes) est disponible en usant du fameux clic gauche sur la capture d’image ci-dessous. Cette vidéo vaut surtout pour l’accent mis sur les précautions indispensables pour l’étude d’un échantillon précieux fossilisé… et dont l’ADN, peu abondant, peut être fragmenté. En outre, des mesures simples mais draconiennes permettent de limiter les sources de contaminations, quand l’ADN moderne peut polluer l’ADN fossile. Le port de sur-chausses, de masque et les changements de blouses, le non croisement des échantillons avant et après amplification sont autant de précautions mises en avant dans cette vidéo… une occasion de visiter virtuellement les laboratoire de l’Institut Jacques Monod.

L’une des problématiques liées à l’étude de l’ADN « fossile » réside dans sa faible quantité disponible. Plusieurs méthodes de biologie moléculaire ont été envisagées pour amplifier ce matériel génétique afin d’en permettre l’expertise. Une publication dans BMC Genomics de 2006, Assessment of whole genome amplification-induced bias throughhigh-throughput, massively parallel whole genome sequencing, relate la comparaison de 3 méthodes d’amplifications pan-génomiques (méthodes WGA pour Wide Genome Amplification) d’ADN qui pourra devenir ensuite la matrice suffisante d’un séquençage haut-débit.

– la PEP-PCR (Primer Extension Preamplification-PCR) : cette technique fait intervenir des amorces aléatoires aux conditions d’appariement à basse température (low melting temperature) qui initieront la PCR

référence : Zhang, L. et al. (1992) Whole genome amplification from a single cell: Implications for genetic analysis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 5847

– la DOP-PCR (Degenerate Oligonucleotide Primed-PCR) : cette technique, quant à elle, fait intervenir des amorces semi-dégénérées (de type : CGACTCGAGNNNNNNATGTGG) qui ont une température d’hybridation supérieure à celles utilisées dans la PEP-PCR

référence : Telenius, H. et al. (1992) Degenerate oligonucleotide-primed PCR: general amplification of target DNA by a single degenerate primer. Genomics 13, 718.

L’utilisation d’une Taq PCR limite la taille des fragments néo-synthétisés qui ne dépassent guère 3 kb.  En outre, ces deux techniques, à l’instar de ce qui peut être démontré dans la publication de BMC Genomics 2006 (mentionnée ci-dessus), induisent des erreurs de séquences accompagnées de nombreux biais d’amplification (certaines régions ne sont pas amplifiées au profit de régions qui deviennent, de fait, sur-représentées).

– la MDA (Multiple Displacement Amplification) : cette amplification iso-thermique fait intervenir des amorces aléatoires de type hexamères et une enzyme, la phi29. Le type d’amplification générée est schématisées sur la figure ci-dessous. L’enzyme surfe à partir du brin néo-synthétisé, déplace un brin complémentaire pour continuer sa synthèse. Ainsi, les brins générés par cette technique peuvent atteindre 100 kb. En outre, la phi29 possède une activité 3′ -> 5′ de relecture (proofreading) lui conférant un taux d’erreur 100 fois moindre que ceux constatés pour des Taq polymérases classiquement utilisées dans les techniques de PEP- ou DOP-PCR

source : Cold Spring Harb Protoc 2011.2011: pdb.prot5552 (la légende originale de la figure est disponible en cliquant sur celle-ci)

Ces techniques d’amplification pangénomique ont rendu possible l’étude d’ADN anciens et peu abondants et tout naturellement elles ont trouvé leur place dans la boîte à outils moléculaires des paléogénéticiens. Cependant, la révolution des séquençages haut-débit (dont nous avons abordé le sujet à plusieurs reprises) laisse entrevoir un nouveau champ des possibles pour l’étude des ADN fossiles. Au fond, des technologies telles que celle développée par Helicos Biosciences, trouvent ici un réel champ d’application à l’instar de ce que développe la publication True single-molecule DNA sequencing of a pleistocene horse bone de Genome Research, 2011- nulle nécessité d’amplifier la matrice de départ. Cette publication compare des technologies de séquençage de 2ème et 3ème générations (GaIIx et Helicos) appliquées au séquençage de l’ADN isolé à partir d’un os de cheval pleistocène conservé dans permafrost. Le séquençage « single molecule« , une chance pour la paléogénomique !