La PCR : la Taq sans concession (1:design d’amorces)

La PCR est l’un des outils de base dans la boîte du biologiste moléculaire. Devenue accessible, totalement démocratisée dans les laboratoires, elle demande cependant une certaine exigence dans son développement.

Dans un premier temps il est essentiel de définir à quel type de PCR nous avons à faire :

– PCR de détection (diagnostic ?) : celle qui vous permet de croire que vous avez dans votre extraction l’agent infectieux que vous tâchez de cibler

– PCR de monitoring : celle qui vous suffit pour admettre que vous validez ou non l’expérience que vous désirez suivre, celle qui vous  dit que vous avez contaminé votre extraction d’ARN en ADN génomique, par exemple

– PCR de production : celle qui vous permet d’obtenir le plus de produit spécifique afin d’exploiter ces quelques centaines de paires de bases pour en faire ce que vous avez imaginé (reporters à spotter sur puce ADN ou insert pour un clonage)

– PCR quantitative : celle qui se résume à estimer du mieux possible la quantité d’acides nucléiques ciblés présents initialement dans une PCR (cDNA, cible pathogène…).

aperçu du design d’amorces PCR

Il est fondamental de reconnaître à quel genre s’apparente la PCR dont vous avez designé les amorces avec le plus grand soin. Peut être parce que les objectifs visés sont réellement différents voire opposés.

Les grandes étapes aboutissant à un design sont résumées ci-dessus. Il convient d’extraire en format FASTA, la séquence qui vous servira de matrice PCR, le logiciel d’aide permettra d’écarter les amorces de qualités douteuses (auto-appariées, peu spécifiques…), la proposition de design sera soumise dans un Blast (dont les paramètres dépendront du type d’application de votre PCR), dans le cas d’une qPCR SybrGreen il peut être intéressant d’utiliser un mFold sur l’amplicon que vous souhaitez générer, enfin l’ulitsation d’un autre service web tel que OligoCalc permettra de valider les paramètres de vos amorces en confrontant ceux-ci à ceux que vous aurez obtenus en sortie de logiciel d’aide au design.

Commençons par aborder les paramètres d’importances de cette technique de biologie moléculaire : la spécificité, la sensibilité, l’efficacité. Quand la PCR de détection cumulera sensibilité et spécificité, la PCR de monitoring devra être efficace et simple à mettre en place (quelques heures de développement entre ces deux variantes…). La première étape, la plus essentielle, consistera à designer des amorces (nous parlerons des sondes ultérieurement). Avant cela il vous faudra vous doter d’une stratégie de design et peut être d’un (le mieux serait plusieurs) logiciel d’aide au design d’amorces. Parmi tous les logiciels disponibles, rien ne sert de casser le cochon, il existe beaucoup de gratuiciels acceptables pour la grande majorité des applications. Parmi ceux-ci, notons :

– FastPCR : quelques bugs, mais globalement cette solution à notre préférence pour sa modularité. Le logiciel gère les PCRs multiplexes, propose un grand nombre d’outils intégrés de manipulations de séquences. Il s’agit de l’une des seules solutions gratuites qui est l’équivalent d’une solution payante (mode d’emploi FastPCR disponible). Le logiciel quant à lui est disponible ici (dans sa version antérieure, plus stable, dont nous voyons une capture d’écran ci-dessous).

Parmi les critères généraux, les paramètres de design transposables à tout type de PCR sont les suivants :

– Longueur des oligonucléotides = 16 à 26 nt

– Taux de GC = 40 à 70% (idéalement autour des 55 %)

– Tm des oligonucléotides ~ 60°C (si vous développez une PCR diagnostique la température d’amorçage = Tm, si vous souhaitez produire il faudra diminuer de 2°C la température d’amorçage par rapport au Tm des amorces)

Du GC%, de la concentration en amorces et de la concentrations en cations dépend le Tm (définie comme la température pour laquelle 50 % d’une séquence donnée  est sous forme double hélice et 50 % est sous forme simple brin). C’est donc ces paramètres qu’il faut intégrer lors du design. Bien maîtrisé, un design permettra de gagner un temps précieux lors des phases de mise au point et d’optimisation d’une PCR. Ceci étant particulièrement vrai pour ce qui concerne la mise au point d’une PCR quantitative.

D’autres paramètres évidents concernent la séquence ciblée en tant que telle. Sachant qu’en fonction de celle-ci la marge de manœuvre est plus ou moins grande.

– maximiser autant que possible les zones de grandes complexité linguistique (celle avec le moins d’homopolymères, FastPCR tient compte de cette notion pour designer des amorces et se sert de ce paramètre pour calculer son indice de qualité de design)

– en 3′ des amorces, sur les 5 dernières bases, autant que possible, rassembler un maximum de bases A ou T (3 A ou T sur ces 5 dernières bases) afin d’en diminuer le Tm en 3′ et ainsi d’accroître la spécificité des amorces designées

Selon le type de PCR à laquelle nous avons à faire les contraintes de design peuvent être radicalement différentes :

– ainsi, vous souhaiterez designer dans 2 exons différents lorsque vous souhaiterez suivre la contamination en ADNg d’une extraction d’ARN par exemple

– ainsi vous souhaiterez designer sur une région à cheval sur 2 exons (sur la base donc d’une séquence cDNA, ARN) pour les applications de qPCR liées à la mesure du niveau de modulation différentielle de votre ARN cible

schéma sur une nappe d’une PCR hybride

Truc et astuce pour diminuer vos coûts de séquençage d’amplicons en SANGER : la PCR hybride !

1/ Réalisation de PCR en tubes indépendants, l’amorce reverse (PCR A) et l’amorce forward (PCR B) des 2 PCR auront des séquences Tag synthétiques complémentaires

2/ La deuxième étape consistera en une élongation unidirectionnelle. Les 2 amplicons synthétisés lors de la PCR 1 s’apparieront grâce à leur séquence Tag complémentaire. Le produit de la PCR2 sera un hybride PCR A-séquence chimérique – PCR B

3/ Une dernière PCR, prenant la Forward de PCR A et la Reverse de PCR B seront utilisées… le produit néosynthétisé pourra être séquencé (2 ou plus pour le prix d’un, en outre bien optimisée ce type de PCR peut permettre d’amplifier des « signaux faibles »).