Point méthodologique: le fingerprinting moléculaire ou comment des tableaux sortent des laboratoires…

Cet article est le prolongement sous forme de fiche technique, de notre article abordant le bio-art.

Commençons par quelques définitions :

fingerprinting = signature moléculaire exploitant les polymorphismes individuels

fingerprinting = (exploitation des polymorphismes pour singulariser un prélèvement) + (séparation sur gel) + (visualisation par hybridation de sondes spécifiques marquées)

L’ensemble du génome humain est commun à tous aux mutations près. Ces mutations se produisent au hasard et se produisent à une moyenne proche de 1 ‰.

Lorsque l’on digère le génome humain (3,5 x 109 bp pour un génome haploïde) par une enzyme de restriction dont le site est à 6 bp (probabilité moyenne de coupure (1/4)6=1/4096 soit 1 site tous les 4 kbp), on obtient de l’ordre de 106 fragments qu’on ne peut examiner un à un pour déterminer la taille d’un fragment particulier. Il faut un moyen de repérer la région où la mutation est susceptible de s’être produite. Une caractéristique unique d’une région particulière d’ADN est sa séquence (à condition de n’être pas de l’ADN répété). Ainsi, après séparation des fragments selon leur taille, un blotting (ou buvardage) sera utilisé pour réaliser la signature moléculaire à l’aide de sondes marquées par un radio-isotope ou avec une molécule « traçante ».

Le southern blot est une technique permettant, après une phase de séparation sur gel, de visualiser spécifiquement des loci ciblés. Cette technique a été mise au point par E. M. Southern qui a combiné électrophorèse, transfert et hybridation avec une sonde marquée pour permettre une détection spécifique d’un locus cible (1975).

Après électrophorèse …

1. Le gel d’électrophorèse est immergé dans une solution alcaline permettant la dénaturation de l’ADN

2. Une membrane de nitrocellulose (ou de nylon) imprégnée d’une solution saline concentrée est appliquée directement sur le gel, un poids la maintient en sandwich entre une couche épaisse de substance absorbante et le gel. Trois moyens sont disponibles pour attirer la solution saline à travers le gel :

– par capillarité

– par électrophorèse

– par succion sous vide

3. La membrane est alors chauffée, dans le cas de nitrocellulose, ou exposée au rayonnement ultra-violet pour le cas du nylon, afin de fixer de manière permanente l’ADN sur la membrane. Une étape de préhybridation permettant de traiter les sites laissés libres, ils seront saturés par une solution contenant une protéine telle que de la sérum albumine et / ou  traités à l’aide d’un détergent comme le laurylsulfate de sodium.

4. Une sonde spécifique marquée complémentaire de l’ADN cible est mise en contact de la membrane sur laquelle il a été transféré.

5. Une phase de « visualisation » de l’hybridation aura lieu soit par autoradiographie dans le cas de l’emploi d’une sonde marquée à l’aide d’un radio isotope (phosphore 32 par exemple) ou par développement d’un film photographique impressionné après réaction de chimioluminescence.

Cette technique est de moins en moins utilisée dans les laboratoires d’identification (police scientifique, laboratoires vétérinaires), elle a été remplacée par l’électrophorèse capillaire après une PCR sur des régions flanquantes de microsatellites (cette technique, beaucoup plus automatisable et standardisable a supplanté le SouthernBlot). Aujourd’hui cette technique tend à être remplacée par des panels de SNPs.

Deux techniques analytiques de biologie moléculaire  dérivent du Southern Blot par goût du jeu de mot, elles ont été nommées :

–         Northern Blot, technique analytique des ARN (James Alwine, David Kemp, and George Stark at Stanford University, 1977)

–         Western Blot, technique analytique des protéines (W. Neal Burnette, 1979-1981)

Le quatrième point cardinal, le Eastern Blot, beaucoup plus marginal consiste en l’analyse des modifications post traductionnelles des protéines.