La PCR numérique : diviser pour plus de sensibilité

La PCR en point final, celle qui se termine souvent par un dépôt sur gel d’agarose, ainsi que la PCR quantitative, dans laquelle on suit l’évolution de la libération de molécules fluorescentes dont le décollage plus ou moins précoce dépend de la quantité de matrice initialement introduite, se voient déclinées en versions numériques. Par numérique est entendu ici, qu’une PCR peut prendre deux valeurs : 0 ou 1 (idéalement, 0 quand aucune cible n’est introduite au départ d’une PCR et que par voie de conséquence aucun signal issu d’amplification n’est observé, et 1 pour l’exact inverse).

Le principe de la PCR numérique est simple au niveau du concept mais techniquement beaucoup plus difficile à mettre en application. Il s’agit de multiplier le nombre de bio-réacteurs disponibles, ainsi, un échantillon sera partitionné en des milliers de compartiments distincts. Ensuite chaque compartiment sera considéré comme autant de réacteurs indépendants… donc en fin de PCR autant de réactions montrant oui ou non une amplification (autant de 0 et de 1), renvoyant à un système binaire. L’application de la Loi de Poisson permettra ensuite d’estimer très finement la quantité initiale de cibles présentes dans l’échantillon de départ.

principe général de la PCR numérique

Les avantages de la PCR numérique par rapport à la qPCR classique sont assez évidents :

– elle permet une quantification absolue sans établir une courbe standard préalable

– elle est plus sensible voire beaucoup plus sensible. Raindance annonce ainsi détecter un mutant parmi 250 000 molécules sauvages avec une limite inférieure de détection de 1 parmi 1.000.000

– elle est moins sensible aux inhibiteurs. Le fait de diluer la matrice ADN complexe de départ pour la répartir dans un nombre important de réacteurs permet de favoriser le départ de PCR

– elle est nettement plus précise. La technologie sera d’autant plus précise que le nombre de compartiments, le nombre de micro-réacteurs sera important

L’article « Digital PCR  hits its stride » (La PCR numérique franchit un nouveau cap) de Monya Baker dans le Nature Methods (juin 2012) permet un aperçu de la technologie qui est passée du concept à des solutions commerciales qui se veulent de plus en plus accessibles.

Actuellement, plusieurs fournisseurs proposent des plateformes aux spécifications très différentes. Les quatre fournisseurs ci-dessous proposent des systèmes de PCR numérique basés sur de la microfluidique pour Fluidigm, des interfaces solides (type OpenArray) de Life Technologies et des micro-gouttes pour Raindance et Biorad.

Ainsi, que le mentionne Jim Huggett (chef d’équipe au LGC), cité dans la publication de Monya Baker (Digital PCR hits its stride), la PCR numérique est réservée à des utilisateurs experts et se trouve encore allouée à des applications spécialisées car encore beaucoup plus chère que la PCR quantitative (traditionnelle) qui reste adaptée à la majorité des applications.