L’art et la manière de développer une qPCR

La qPCR est une méthode permettant de doser la quantité d’acides nucléiques ciblés introduits dans une réaction de PCR. Pour des raisons de rapidité, de sensibilité et de coût, souvent l’option de travailler avec un agent intercalant (sans sonde) est choisie. La bonne vieille qPCR SybGreen nécessitant le seul design d’une paire d’amorces…

Simple ? Pas nécessairement, car cette approche, certainement plus que la version qPCR Taqman nécessite un travail in silico et de validation/optimisation expérimentales comme passages obligés. C’est ce que montre la publication de Stephen Bustin et Jim Huggett dans Biomolecular Detection and Quantification. Cette publication incontournable pour les férus de qPCR SybrGreen est un beau travail pour lequel la publication vous est mise à disposition en cliquant ci-dessous. On attend ardemment une déclinaison Taqman, HRM, MolecularBeacon de ce type de revues permettant de formaliser des procédures visant à optimiser l’approche d’optimisation.

La quantification par qPCR SybrGreen suppose une relation linéaire entre le logarithme de la quantité initiale introduite en PCR et la valeur Cq obtenue lors de l’amplification. Ceci permet de calculer l’efficacité d’amplification d’un test et de borner ses limites de détection et de quantification. Les caractéristiques d’un test qPCR (bien) optimisé sont les suivantes:

• Une excellentissime spécificité révélée par un pic unique lors de l’établissement de la courbe de fusion

• Une efficacité d’amplification élevée (95-105%)

• Une courbe étalon linéaire (R2 > 0,980)

• Une bonne répétabilité

• Peu ou prou de dimères d’amorces

Pour paraphraser la conclusion de l’article, afin de finir par convaincre de lire cet « essentiel » de la qPCR :

La conception, le design d’une PCR est souvent au cœur de tout projet de recherche visant à quantifier les acides nucléiques. Il doit être réalisé avec soin, mais peut être simplifié en suivant un flux de travail simple, comme décrit ci-dessus (cf. diagramme workflow design qPCR).

Cela signifie généralement une spécificité absolue, l’absence de structures en épingle à cheveux ou de potentielles dimérisations croisées. Une bonne conception des essais doit tenir compte de la structure de l’amplicon (paramètre souvent négligé) et veiller à ce que les cibles de l’amorce soient exempts de structure secondaire. Il existe de nombreuses opinions et lignes directrices; une recherche sur Internet pour les termes « qPCR Assay Design » renvoie 695.000 pages. Cependant, bon nombre de ceux-ci sont basés sur des mythes ou peuvent être appropriés pour la PCR mais nécessitent des modifications subtiles (ou moins subtiles) pour être utilisés pour développer une qPCR. Chaque « nouveau » dosage doit être correctement validé, la validation in silico servant de filtre initial pour éliminer des designs ne permettant pas d’aboutir à une bonne qPCR. L’optimisation et la validation empirique sont une partie essentielle, mais souvent négligée, de toute expérience qPCR. Cela s’applique aussi bien aux essais nouvellement conçus qu’aux essais obtenus en reprenant des amorces issues d’une publication, par exemple. Avec tant d’essais prêts à l’emploi, on peut se demander pourquoi quelqu’un voudrait se donner la peine de concevoir un autre essai. D’autant plus que l’on a l’impression que la conception de son propre test est beaucoup plus complexe et peu commode que de simplement l’acheter à un fournisseur commercial, qui en tout cas aura validé chacun de ses tests. Cette perception est erronée pour deux raisons:

1° il se peut que les amorces commerciales ou les conditions d’analyse n’aient pas été validées ou optimisées de façon expérimentale.

2° on ne peut pas présumer qu’un ensemble d’amorces produira les mêmes résultats dans des conditions expérimentales différentes puisque la performance du dosage peut varier selon les méthodes d’extraction utilisées pour purifier les acides nucléiques.